Zakład Fitochemii (NFC)

Kierownik:

dr hab. Iwona Kowalska
e-mail: Iwona.Kowalska@iung.pulawy.pl
tel. 81 4786 883 

Sekretariat

e-mail: biochem@iung.pulawy.pl
tel. 81 4786 880

Siedziba Zakładu znajduje się w Centrum INCBR
adres: ul. Krańcowa 8, 24-100 Puławy

Profil badawczy Zakładu

1. analizy jakościowe i ilościowe związków organicznych obecnych w roślinach i w żywności funkcjonalniej
2. badania budowy chemicznej, aktywności biologicznej, występowania oraz możliwości praktycznego wykorzystania biologicznie czynnych substancji swoistych roślin
3. opracowanie i doskonalenie metod oznaczania zawartości wybranych składników roślinnych
4. badania jakości biomasy pod kątem przydatności do produkcji biogazu;
5. analizy elementarne materiału roślinnego pod kątem zawartości pierwiastków biogennych
6. określanie wpływu czynników środowiskowych, agrotechnicznych i genetycznych na skład jakościowy i ilościowy substancji wpływających na wartość żywieniową roślin uprawnych
7. badania roślinnych odpadów poekstrakcyjnych
8. badania wpływu czynników biotycznych i abiotycznych na skład chemiczny roślin

Oferta

1. • Wyznaczanie dokładnej masy cząsteczkowej oraz wzorów sumarycznych związków chemicznych z dokładnością pomiaru poniżej 1 ppm i przy uwzględnieniu rozkładu izotopowego; zarówno dla związków czystych, jak i będących składnikami mieszanin rozdzielanych za pomocą GC lub UHPLC, z użyciem spektrometru mas wysokiej rozdzielczości. Możliwe jest również wyznaczanie dokładnej masy jonów fragmentacyjnych dla analizowanych związków.
   • Określanie struktur substancji naturalnych – NMR.
   • Wykonywanie ekstraktów roślinnych, ich oczyszczanie oraz izolacja standardów związków do badań żywieniowych i aktywności biologicznej. Ekstrakcja olejków eterycznych.
   • Oznaczanie w roślinach, produktach pochodzenia roślinnego, surowcach i produktach farmaceutycznych:
     • saponin steroidowych i triterpenowych oraz glikoalkaloidów steroidowych –UHPLC-MS,
     • zawartości związków fenolowych (kwasy fenolowe, flawonoidy i izoflawonoidy, katechiny, antocyjany) – HPLC-DAD, UHPLC-MS,
     • kwasów hydroksamowych – UHPLC-MS,
     • glikozydów cyjanogennych – UHPLC-MS,
     • witamin rozpuszczalnych w wodzie (witaminy C i z grupy B) – UHPLC-MS,
     • mono- i oligosacharydów – UHPLC-MS,
     • glukozynolanów – UHPLC-MS,
     • aminokwasów – UHPLC-MS/MS (w nawozach, stymulatorach wzrostu i roślinach).
   • Oznaczania zawartości włókna surowego oraz jego frakcji tzw. frakcji neutralno-detergentowej (NDF), kwaśno-detergentowej (ADF) i kwaśno-detergentowej ligniny (ADL) w materiale biologicznym. Oznaczenie zawartości celulozy, hemicelulozy i ligniny.
   • Analizy zawartości pierwiastków biogennych C, H, N, S i O w próbkach roślinnych, glebie, biomasie, paliwach, ściekach itp.
   • Oznaczanie zawartość białka ogólnego, wartości kalorycznej i teoretycznego uzysku biogazu dla badanego materiału.
   • Badania nad przebiegiem procesu fermentacji metanowej w trybie stacjonarnym i ciągłym, z wykorzystaniem różnych substratów, nad oceną ich przydatności do produkcji biogazu poprzez wyznaczenie uzysku biogazu i metanu.
   • Badania nad wpływem substancji szkodliwych lub stymulujących proces fermentacji metanowej.
   • Badanie składu biogazu pod kątem zawartości metanu, dwutlenku węgla i tlenu (w zakresie od 0 do 100% z dokładnością do 0.5%), siarkowodoru (w zakresie 0 – 10000 ppm) i amoniaku (w zakresie 0-1000 ppm).

Wyposażenie

Laboratorium NMR – spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego

Laboratorium specjalizuje się w analizie fitochemicznej – związków organicznych obecnych w roślinach – w tym metabolitów swoistych (drugorzędowych), m.in. kwasów fenolowych, flawonoidów i saponin. Posiadamy wypracowany zestaw eksperymentów, które skutecznie pozwalają badać rodzaj aglikonu i połączenia między cukrami. Oferujemy zarówno analizy jakościowe, jak i ilościowe metodą ERETIC2, ale także fachową pomoc w interpretacji wyników.

Spektrometr AVANCE III HD 500 MHz Bruker

Laboratorium wyposażone jest w spektrometr, wraz z głowicami pomiarowymi do pomiarów próbek ciekłych (w zakresie 20-100°C):

• PA BBI 500S1 H-BB-D-05 Z – szerokopasmowa (zakres ³¹P-¹⁰⁹Ag, w tym ¹³C, ¹⁵N), gradientowa (oś z), inwersyjna ze szczególnym przeznaczeniem do pomiarów ¹H oraz widm korelacyjnych, np. COSY, NOESY, HSQC, HMBC, itp.
• PA DUL 500S1 C-H-D-05 Z – dwujądrowa, do obserwacji ¹H/¹³C, ze szczególnym przeznaczeniem do pomiarów ¹³C.

Rutynowo wykonujemy następujące eksperymenty:

• jednowymiarowe – ¹H i ¹H z supresją rozpuszczalnika, ¹³C (w tym InverseGated/DEPT/DEPTq i UDEFT), selektywne COSY, TOCSY (w tym CSSF-TOCSY), NOESY (w tym CSSF-NOESY), ROESY i step-NOESY, pomiar T₁;
• dwuwymiarowe – dqf-COSY, 2D-TOCSY (również z supresją rozpuszczalnika), 2D-NOESY (również z supresją rozpuszczalnika), 2D-ROESY (również z supresją rozpuszczalnika), HSQC (również z supresją rozpuszczalnika), HSQC-TOCSY, HSQC-HECADE (pomiar J_CH), H2BC, HMBC, CPMG-HSQMBC i J-HMBC (pomiar J_CH), 1,1-ADEQUATE (tylko dla próbek bardzo stężonych), selektywne 2D-HSQC i selektywne 2D-HMBC.

Laboratorium MS – spektrometrii mas

Zakład Fitochemii specjalizuje się w analizie związków organicznych wytwarzanych przez rośliny, przede wszystkim należących do grupy metabolitów specyficznych (wtórnych). W laboratorium wykonywane są pomiary widm masowych w trybie MS i MSn (widma fragmentacyjne). Umożliwia to identyfikację badanych substancji, a także określenie ich ilościowej (również śladowej) zawartości w badanym materiale.

Spektrometr umożliwia ustalanie składu pierwiastkowego badanych związków chemicznych przez precyzyjny pomiar stosunku masy do ładunku tworzonych przez nie jonów. Hybrydowa konstrukcja oparta na analizatorze kwadrupolowym w połączeniu z analizatorem czasu przelotu, pozwala również na uzyskiwanie widm rozpadowych i identyfikację związków na ich podstawie. Spektrometr jest wyposażony w wymienne źródła jonów, pozwalające na zjonizowanie szerokiej gamy związków chemicznych przez elektrorozpylanie (ESI), jonizację chemiczną w ciśnieniu atmosferycznym (APCI, GC-APCI) lub fotojonizację w ciśnieniu atmosferycznym (APPI).

Dzięki połączeniu spektrometru z osprzętem towarzyszącym: systemami chromatografii ultrasprawnej cieczowej (UHPLC, Dionex UltiMate 3000RS), chromatografii gazowej (GC, Bruker Scion 456) oraz elektroforezy kapilarnej (CE, Agilent 7100) możliwe są wszechstronne analizy ilościowe i jakościowe skomplikowanych mieszanin związków chemicznych.

Zastosowania spektrometru:

• analizy metabolomiki ukierunkowanej i nieukierunkowanej w próbkach materiału roślinnego,
• analizy lipidomiki w próbkach nasion i innych materiałach,
• analizy ilościowe związków pozbawionych chromoforów z wykorzystaniem detektora uniwersalnego typu CAD,
• analizy FAME w różnych materiałach wejściowych,
• ustalanie masy cząsteczkowej i składu pierwiastkowego wyizolowanych metabolitów roślinnych.

System ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej ACQUITY Premier UPLC^TM sprzężony ze spektrometrem mas typu potrójny kwadrupol (Xevo TQ-XS) firmy Waters

W skład chromatografu cieczowego wchodzą dwa detektory: fotodiodowy (PDA), działający w zakresie fal 190–800 nm, oraz rozproszenia światła (ELSD), o częstotliwości zbierania danych 80 Hz. Spektrometr mas o niskiej rozdzielczości pozwala na skanowanie mas do 2000 Da oraz jest wyposażony w dwa źródła jonów: elektrorozpylanie (ESI) oraz jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI). System UPLC-MS umożliwia prowadzenie szybkich (około 10 min) rozdziałów chromatograficznych w układzie odwróconych faz (RP) lub oddziaływań hydrofilowych (HILIC).

Zastosowania chromatografu:

• analizy ilościowe zawartości metabolitów specyficznych, w tym polifenoli, saponin, terpenoidów, alkaloidów, glikozydów i innych, w materiale roślinnym (ekstraktach roślinnych, paszach i produktach spożywczych),
• oznaczenia zawartości wolnych aminokwasów, monosacharydów oraz witamin,
• inne rodzaje jakościowych i ilościowych analiz UHPLC-MS.

 

Systemy wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC

Zakład dysponuje chromatografami cieczowymi typu:

• HPLC – PDA firmy Waters (HPLC Waters 600 S sprzężony z detektorem fotodiodowym (PDA) od 190 – 600 nm) z zakresem przepływów od 0,5 do 4,0 ml/min,

• HPLC – PDA – FLD firmy  Dionex sprzężony z detektorem fotodiodowym w zakresie 180 – 560 nm oraz detektorem fluorescencyjnym (FDA) z zakresem przepływów od 0,5 do 8,0 ml/min,

• Półpreparatywny HPLC – ELSD firmy Gilson sprzężony z detektorem laserowym światła rozproszonego (ELSD) o zakresie przepływów od 1 do 12 ml/min.

Zastosowania chromatografów:

• izolacja metabolitów wtórnych (wysokiej czystości) do określenia struktury metodą NMR oraz badania aktywności biologicznych,
• izolacja substancji wzorcowych do standaryzacji materiałów biologicznych, żywności i pasz.

 

Laboratorium biomasy

Automatyczny analizator włókna surowego ANKOM DELTA

Automatyczny analizator włókna surowego model DELTA firmy ANKOM Technology jest aparatem pracującym w technologii „filter bag”. Analiza wykonywana jest zgodnie z metodą van Soest’a. Aparat daje możliwość pracy z dowolnymi próbkami biologicznymi, materiałem roślinnym, próbkami żywnościowymi itp. Posiada możliwość analizy 24 próbek jednocześnie. Dozowanie odczynników, sterowanie temperaturą, kontrola szczelności aparatu, mieszanie próbek, odpompowywanie pozostałości po ekstrakcji odbywa się w sposób w pełni automatyczny. Aparat cechuje się intuicyjnym panelem stresującym, umożliwiającym łatwe przełączanie pomiędzy metodami.

Zastosowanie analizatora:

• oznaczanie zawartości włókna surowego oraz jego frakcji tzw. frakcji neutralno-detergentowej (NDF), kwaśno-detergentowej (ADF) i kwaśno-detergentowej ligniny (ADL) w materiale biologicznym,
• oznaczanie zawartości celulozy, hemicelulozy i ligniny.

Analizator elementarny CHNS/O

Aparat FlashSmart firmy Thermo Scientific jest najnowocześniejszym, automatycznym analizatorem elementarnym na rynku, zapewniającym najbardziej powtarzalne i czułe pomiary różnego rodzaju próbek – węgli, biomasy, paliw stałych, płynnych, związków organicznych, farmaceutyków, itp. Analizator wykorzystuje metodę dynamicznego wysokotemperaturowego spalania próbek w piecu z elektronicznie sterowaną temperaturą, separację powstających gazów na kolumnie i ich detekcję na wysokiej czułości detektorze termo-przewodnościowym (TCD).  Aparat wyposażony w dwa oddzielne piece reakcyjne z elektroniczną kontrolą temperatury, kompatybilne z reaktorami spaleniowo-redukcyjnymi do analizy C, H, N, S i reaktorem pirolitycznym do analizy O, pracujące niezależnie. Aparat jest w pełni automatyczny, umożliwia pracę bez konieczności przezbrajania, demontowania/montowania jakichkolwiek elementów. Przełączanie pomiędzy kanałami pomiarowymi odbywa się z poziomu oprogramowania sterującego.

Zastosowanie analizatora:

• analiza zawartości pierwiastków biogennych C, H, N, S i O w próbkach roślinnych, glebie, biomasie, paliwach, ściekach itp.,
• oznaczanie zawartość białka ogólnego, wartości kalorycznej i teoretycznego uzysku biogazu dla badanego materiału.

Zestaw fermentorów Biogas Test Plant (BTPs)

Biogas test plant (BTPs) wyprodukowany przez firmę Umweltleistungen (UIT) to zestaw trzech fermentorów o pojemności 20 L, z oprzyrządowaniem służącym do kontroli najważniejszych parametrów procesu fermentacji metanowej, takich jak temperatura, pH, prędkość i cykl mieszania, ilość i skład biogazu – zawartość metanu, dwutlenku węgla, siarkowodoru i tlenu. Urządzenie pozwala na przeprowadzenie procesu fermentacji w trybie stacjonarnym, jak również ciągłym. Daje możliwość dodawania i pobierania próbki bez zakłócania trwającego procesu. Urządzenie rejestruje mierzone wartości powyższych parametrów, które następnie można przeglądać na ekranie monitora, wyświetlać w formie wykresów lub pobrać na nośnik pamięci.

Zastosowanie zestawu fermentorów:

• badania nad przebiegiem procesu fermentacji metanowej w trybie stacjonarnym i ciągłym, z wykorzystaniem różnych substratów, nad oceną ich przydatności do produkcji biogazu poprzez wyznaczenie uzysku biogazu i metanu,
• badania nad wpływem substancji szkodliwych lub stymulujących proces fermentacji metanowej,
• produkowanie osadu pofermentacyjnego z konkretnie dobranych substratów do badań nad jego nawozowym wykorzystaniem.

Przenośny analizator biogazu GA 5000

Przenośny analizator biogazu GA 5000 firmy GeoTech z dużym, kolorowym wyświetlaczem, wyposażony w czujniki podczerwieni do pomiaru zawartości metanu i dwutlenku węgla oraz elektrochemiczne cele pomiarowe do pomiaru zawartości tlenu, siarkowodoru i amoniaku. Urządzenie posiada certyfikat ATEX II oraz certyfikat kalibracji UKAS (ISO 17025). Analizator może być stosowany zarówno w laboratorium, jak i w terenie.

Zastosowanie analizatora:

• badanie składu biogazu pod kątem zawartości metanu, dwutlenku węgla i tlenu (w zakresie od 0 do 100% z dokładnością do 0.5%), siarkowodoru (w zakresie 0 – 10000 ppm) i amoniaku (w zakresie 0-1000 ppm).

Laboratorium przygotowania próbek

Zakład wyposażony jest w sprzęt umożliwiający przygotowanie próbek z zachowaniem wszelkiej ostrożności na każdym etapie, tak aby czynniki otoczenia nie wpływały na zawartość substancji chemicznie nietrwałych.

Liofilizator umożliwia liofilizację próbek w szerokim zakresie temperatur (-55°C) – (+50°C) i ciśnień (<0,01 mbar). Urządzenie pozwala na sublimacyjne usuwanie wody (oraz niektórych rozpuszczalników organicznych, np. t-BuOH, DMSO) w obniżonej temperaturze i pod zmniejszonym ciśnieniem, z zamrożonych roztworów oraz materiałów biologicznych, np. ekstraktów, zawiesin, całych roślin i owoców/warzyw. Dzięki zastosowaniu obniżonej temperatury możliwe jest suszenie próbek termolabilnych.

Liofilizacja jest wykonywana na 5 półkach o średnicy 20 cm oraz 3 półkach o średnicy 37 cm.

 

Ekstraktor pozwala znacznie skrócić czas ekstrakcji i zmniejszyć zużycie rozpuszczalnika nawet o 90%. Autosampler z 24 miejscowym rotorem oraz cele ekstrakcyjne dostępne w rozmiarach od 1 mL do 33 mL, umożliwiają wykonanie serii analiz próbek w szerokim zakresie wagowym. System umożliwia zastosowanie zarówno wodnych jak i organicznych rozpuszczalników. Możliwość sterowania temperaturą i ciśnieniem, przyspiesza kinetykę procesu ekstrakcji, nie dopuszczając do wrzenia rozpuszczalnika, co sprawia, że ekstrakcja jest bezpieczniejsza, szybsza i bardziej wydajna niż tradycyjne metody.

 

Urządzenie do ekstrakcji mikrofalowej lotnych produktów naturalnych (Ethos X) wraz z wyposażeniem

Jest to urządzenie do bezrozpuszczalnikowej ekstrakcji, wykorzystujące technikę hydrodyfuzji mikrofalowej. Promieniowanie mikrofalowe nagrzewa wodę zawartą w komórkach materiału roślinnego poddawanego ekstrakcji, co powoduje rozerwanie ich ścianek i uwolnienie lotnych związków organicznych (olejki eteryczne). Olejki razem z parą wodną trafiają do chłodnicy zwrotnej, gdzie ulegają skropleniu, a następnie do odbieralnika. W porównaniu do klasycznej metody destylacji z parą wodną zaletą ekstrakcji mikrofalowej jest krótki czas procesu oraz większa wydajność procesu. Urządzenie to w konfiguracji z odbieralnikiem grawitacyjnym umożliwia otrzymanie mniej lotnych związków organicznych.

Wyparka ta umożliwia pracę w skali półtechnicznej. Pozwala na odparowanie rozpuszczalników organicznych jak i wody z ekstraktów roślinnych i innych materiałów przy zachowaniu niskiej temperatury roztworu, co jest bardzo ważne przy przetwarzaniu wrażliwych na temperaturę substancji. Chemoodporna pompa próżniowa KNF SBC LABOBASE 860 (60 L/min, ciśnienie końcowe 2 mbar) i wydajna chłodnica zasilana cyrkulatorem Huber Unichiller UC025 (2,5 kW przy 15° C) pozwalają na szybkie odparowanie cieczy w szerokim zakresie temperatur wrzenia. Dodatkowo, możliwe jest odparowanie roztworów wykazujących tendencję do rozpryskiwania i pienienia się. Wyparka wyposażona jest w kolby o pojemności 10 i 20 litrów.